1. 泛基因組構(gòu)建流程

      人類泛基因組參考聯(lián)盟（HPRC）開(kāi)發(fā)了兩條主要的泛基因組圖譜構(gòu)建流程：Minigraph-Cactus（MC）和PanGenome Graph Builder（PGGB）。

      MC將minigraph用作圖譜構(gòu)建工具。用戶選定的參考基因組被用作初始主干，隨后逐步添加來(lái)自其他基因組的結(jié)構(gòu)變異。所有組裝結(jié)果會(huì)使用類似minimap2的算法回比到圖譜上，為每條參考染色體生成堿基層面的比對(duì)。MC采用了無(wú)參考比對(duì)工具Progressive Cactus的改良版本，將這些比對(duì)結(jié)果整合為包含各種大小變異的堿基層面泛基因組圖譜，然后將染色體圖譜合并，通過(guò)折疊冗余序列來(lái)降低路徑復(fù)雜度。除了選定的參考基因組，用戶還可以指定其他帶有坐標(biāo)的組裝結(jié)果，這些結(jié)果在下游分析中可作為參考 。

      與MC不同，PGGB 不使用初始參考基因組，而是利用wfmash進(jìn)行全基因組兩兩比對(duì)。seqwish作為序列到圖譜的比對(duì)工具，它從全基因組兩兩比對(duì)開(kāi)始，生成一個(gè)完整的泛基因組圖譜，能夠呈現(xiàn)所有類型和大小的變異。隨后，該圖譜會(huì)經(jīng)過(guò)平滑和歸一化的后處理步驟。在PGGB生成的泛基因組圖譜中，圖譜內(nèi)包含的每個(gè)基因組都可作為下游分析的參考。

      泛基因組圖譜可以使用變異圖譜工具包（vg）與轉(zhuǎn)錄本注釋相結(jié)合，vg 是一種用于變異圖譜構(gòu)建、處理和分析的軟件，可將其轉(zhuǎn)化為剪接感知圖譜，其中通過(guò)節(jié)點(diǎn)（外顯子）和邊（剪接連接點(diǎn)）的路徑代表mRNA轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。通過(guò)將一組單倍型特異性轉(zhuǎn)錄本投影到一組已知單倍型上，構(gòu)建泛轉(zhuǎn)錄組也是可行的 。

      泛基因組圖譜的大小取決于相應(yīng)物種的基因組大小，但因?yàn)檎狭似渌麄€(gè)體的輔助序列所以會(huì)比單個(gè)參考基因組更大，同時(shí)也受到個(gè)體數(shù)量、多樣性以及構(gòu)建流程的影響。MC圖譜的大小相對(duì)接近物種的基因組大小。相比之下，PGGB圖譜的大小可能會(huì)顯著超過(guò)基因組大小以及MC圖譜。PGGB圖譜較大的原因在于它能夠捕捉高度分化的衛(wèi)星區(qū)域、著絲粒區(qū)域和異染色質(zhì)區(qū)域，而 MC圖譜將這些區(qū)域排除在外。PGGB還有將復(fù)雜區(qū)域（如拷貝數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)）壓縮為單拷貝的傾向，從而在圖譜中產(chǎn)生環(huán)，增加了圖譜的復(fù)雜性。鑒于 PGGB圖譜更大且更復(fù)雜，與MC圖譜相比，它需要更多的計(jì)算資源。最近發(fā)布了PGGB流程的Nextflow實(shí)現(xiàn)版本，以提高集群的可擴(kuò)展性。不過(guò)也有項(xiàng)目表明，PGGB可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)序列變異性的高估。

      鑒于存在這些差異，謹(jǐn)慎選擇泛基因組圖譜構(gòu)建流程至關(guān)重要?？偟膩?lái)說(shuō)，MC推薦應(yīng)用于重測(cè)序項(xiàng)目作為參考，而當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注特定區(qū)域時(shí)，PGGB就更適合選擇?？傮w而言，泛基因組圖譜面臨概念和計(jì)算方面的挑戰(zhàn)，目前其構(gòu)建、存儲(chǔ)和分析所需的資源比線性基因組要多得多。但這些限制因素正在逐步被解決。

2. 提高泛基因組信息的可獲取性

      泛基因組圖譜蘊(yùn)含著廣泛而復(fù)雜的生物信息，包括個(gè)體間的基因組關(guān)系和多樣性。其錯(cuò)綜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了海量數(shù)據(jù)，在瀏覽和解讀時(shí)頗具挑戰(zhàn)。為改善下游分析軟件對(duì)圖譜的可訪問(wèn)性，進(jìn)而便于從泛基因組圖譜中提取生物信息，目前開(kāi)發(fā)了泛基因組圖譜多種處理工具包。主要包括排序、索引、修剪和子采樣等。排序可優(yōu)化圖譜節(jié)點(diǎn)的順序，路徑索引能更快速地訪問(wèn)圖譜的特定區(qū)域，修剪可以進(jìn)一步加快計(jì)算速度，可以通過(guò)修剪復(fù)雜或不可靠的區(qū)域，或?qū)ψ訕颖居脩舳x的坐標(biāo)，來(lái)簡(jiǎn)化圖譜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)計(jì)算資源不足以覆蓋整個(gè)圖譜，或想要梳理特定感興趣區(qū)域的復(fù)雜性時(shí)，子采樣也非常重要。

      目前主要有兩個(gè)用于處理泛基因組圖譜的軟件包：vg 和泛基因組分析工具包ODGI。vg依賴于.vg格式，是首個(gè)可擴(kuò)展到千兆堿基規(guī)模圖譜的工具。ODGI基于以節(jié)點(diǎn)為中心的對(duì)象（.og）運(yùn)行，針對(duì)包含數(shù)百個(gè)單倍型解析基因組的泛基因組圖譜進(jìn)行了優(yōu)化。比較注釋工具包（CAT）也可以通過(guò)將參考基因注釋投射到每個(gè)基因組上，對(duì)泛基因組圖譜中的單倍型進(jìn)行注釋，這有助于簡(jiǎn)化物種內(nèi)的注釋工作。

3. 泛基因組可視化

      泛基因組圖譜可視化能夠?qū)徱暬蚪M之間的同源關(guān)系和變異情況，為潛在的生物學(xué)數(shù)據(jù)提供深刻見(jiàn)解。有多種工具可用于泛基因組圖譜可視化。Bandage和GfaViz最初是為可視化組裝圖譜而創(chuàng)建的，它們可以生成二維圖譜布局，允許以交互方式查看節(jié)點(diǎn)和邊，變異在布局中以氣泡形式呈現(xiàn)。vg viz 可以可視化節(jié)點(diǎn)、邊、路徑以及序列之間的堿基變異。SequenceTubeMap以一維 “管狀圖譜” 模型呈現(xiàn)這些元素，其中代表基因組的路徑從左到右在圖譜的序列節(jié)點(diǎn)間串聯(lián)。

      為了適用于千兆堿基規(guī)模的泛基因組，如人泛基因組，MoMI-G 將 SequenceTubeMap 的堿基層面可視化與Circos的染色體圈圖相結(jié)合，以便高效瀏覽基因組之間的結(jié)構(gòu)變異（SVs）和比對(duì)數(shù)據(jù)。ODGI 可以以二維或一維形式呈現(xiàn)圖譜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Waragraph 是ODGI的交互式版本，目前正在開(kāi)發(fā)中，旨在實(shí)現(xiàn)一維和二維可視化的查看。

圖2：泛基因組圖譜構(gòu)建流程