01 T2T-sheep1.0顯著提高了參考基因組質(zhì)量

T2T-sheep1.0的所有28條染色體上，共識別出約220.05 Mb的之前NCBI參考基因組Ramb_v3.0未解決區(qū)域（PURs），這些PURs在Ramb_v3.0的染色體上均是未組裝或錯誤組裝。這些PURs大多位于著絲粒區(qū)域和富含重復序列的區(qū)域以及端粒區(qū)域。

T2T-sheep1.0填補的gaps區(qū)域中注釋了一些基因并在特定組織上有表達。例如，位于Chr01缺口中的基因ID“Gene1808”（注釋為HNRNPK）在背最長肌、大腦和下丘腦組織中表達。T2T-sheep1.0注釋了超過96%的BUSCO，Ramb_v3.07中僅注釋了93.9%的BUSCO，而其他15個綿羊基因組組裝中僅注釋了91.2–92.4%的BUSCO。通過比較這些組裝中兩種已知著絲粒衛(wèi)星序列的總長度，T2T-sheep1.0在兩種衛(wèi)星序列上的長度都是最長的，表明其在著絲粒組裝上是最完整的。

T2T-sheep1.0 糾正了 Ramb_v3.0 中的許多組裝的結構錯誤。一些大片段倒位的SVs通過多條reads的支持被確認為組裝錯誤?；蚪M質(zhì)量的提升也反映在 T2T-sheep1.0 的全基因組平均 QV 為 51.53，而 Ramb_v3.0的 QV 為 44.77。

02 T2T-sheep1.0基因組注釋

T2T-sheep1.0 基因組序列中有 47.67%（1360.45 Mb）為重復序列，高于 Ramb_v3.0 中觀察到的 44.10%（1164.82 Mb）。著絲粒周圍區(qū)域（PURs）也可能包含大量的重復序列元件，這對準確組裝構成了巨大挑戰(zhàn)。研究人員發(fā)現(xiàn) PURs 中的重復序列含量遠高于其他染色體區(qū)域。著絲粒特異性衛(wèi)星序列和節(jié)段性重復（SDs）占 PURs 的 70.78%。在 T2T-sheep1.0 的 PURs 中，286,173 個衛(wèi)星位點（157.10 Mb）和 10,214 個 SDs（50.76 Mb）分別占全基因組中所有衛(wèi)星和 SDs 的 96.89% 和 19.65%。

在去除轉(zhuǎn)座子基因后，共獲得了 21,517 個高置信度的蛋白質(zhì)編碼基因，其中 754 個是新注釋的基因，均位于 PURs 中。并且 99% 的蛋白質(zhì)編碼基因基于NR和KEGG公共數(shù)據(jù)庫進行了注釋。在 T2T-sheep1.0 的染色體上搜索了 Ramb_v3.0中未組裝出來的新組裝區(qū)域（NARs），在 T2T-sheep1.0 的 NARs 中共鑒定出 712 個新組裝基因（NAGs）?；?RNA-seq 數(shù)據(jù)，PURs 和 NAGs 中新注釋的基因在多種組織中均轉(zhuǎn)錄表達，如脂肪、血液、瘤胃和下丘腦。另外在 T2T-sheep1.0 的 25 條染色體的著絲粒區(qū)域中注釋新增了 147個基因。

03 基因家族和SDs

T2T-sheep1.0 與另外三個羊參考基因組組裝（Ramb_v3.0、盤羊CAU_O.ammon_polii_1.0和山羊ARS1）相比，基因家族的拷貝數(shù)明顯增加，存在明顯的基因家族擴張。此外，基因家族擴張與節(jié)段性重復（SDs）的富集存在強烈關聯(lián)。

T2T-sheep1.0 和 Ramb_v3.0 的 28 條染色體（26 條常染色體和 X、Y 染色體）上分別鑒定了 111.06 Mb 和 20.55 Mb 的非冗余SDs序列。SDs覆蓋了2622個基因。與 T2T-sheep1.0 相比，Ramb_v3.0 中 SDs 和旁系同源基因的減少可能是由于重復序列不完整的組裝。在所有的 SDs 中，有 45.71% 與 T2T-sheep1.0 的 PURs 重疊，覆蓋50.76 Mb。特別是Y 染色體上 PURs 內(nèi)的4.52 Mb SDs被證明與三個基因家族（TSPY、HSFYZFY）的串聯(lián)重復有關。此外，研究人員對全球野生和家養(yǎng)綿羊的選擇性清除分析發(fā)現(xiàn)SDs富集區(qū)域中與串聯(lián)重復基因相關的強烈信號。

04 著絲粒區(qū)域及其重復序列特征

11個綿羊近端著絲粒染色體具有相似的衛(wèi)星序列，組裝的時候發(fā)現(xiàn)它們之間形成了具有纏繞的組裝結構構圖，這些纏繞的結構后續(xù)鑒定為著絲粒重復序列，基于磷酸化CENP-A（Ser7）抗體的ChIP-seq確定了這些著絲粒區(qū)域。著絲粒區(qū)域富含高度超甲基化的CpG，Chr02上的整個著絲粒區(qū)域都被超甲基化區(qū)域所覆蓋。著絲粒的長度范圍從0.36 Mb到22.63 Mb不等，但與染色體長度沒有關聯(lián)。

由高階重復序列（HORs）組成的衛(wèi)星DNA主導了常染色體和X染色體的著絲粒區(qū)域。這些衛(wèi)星重復序列分為三類：SatI（816 bp）、SatII（702 bp）和SatIII（22 bp）。SatI和SatII分別對應于之前描述的兩種衛(wèi)星序列，它們在T2T-sheep1.0的著絲粒區(qū)域中占主導地位。作者確定了SatII的大小為702 bp，而不是之前報道的約400 bp，并發(fā)現(xiàn)了一種新的衛(wèi)星序列SatIII。通過熒光原位雜交（FISH）試驗驗證了著絲粒SatIII重復序列陣列。此外，作者根據(jù)序列一致性和相似性熱圖在綿羊中觀察到了著絲粒衛(wèi)星的進化層次。例如，在X染色體上，SatII主導了著絲粒區(qū)域，并且在SatII HORs中至少識別出了兩層。另外還檢測到了其他重復單元如LINEs和SINEs插入到著絲粒區(qū)域。與著絲粒區(qū)域內(nèi)的基因相比，著絲粒周圍區(qū)域的基因表達水平較高。

05 著絲粒衛(wèi)星序列和染色體融合的演化

綿羊在染色體中心融合方面經(jīng)歷了顯著的演化事件，特別是Chr1、Chr2和Chr3這三個亞中著絲粒染色體。在它們的野生祖先和相關物種中，兩個端著絲粒染色體上發(fā)生了非等位同源重組（NAHR），從而產(chǎn)生了亞中著絲粒染色體。作者研究了盤羊的基因組，以追溯其染色體重組過程，并將山羊基因組作為外群。綿羊、盤羊和山羊之間的共線性明顯揭示了山羊6條染色體與兩種綿羊物種的3條染色體之間的二對一融合關系。基于山羊和這兩種綿羊物種染色體上的著絲粒位置，作者建立了涉及著絲粒衛(wèi)星痕跡的染色體融合模式。

另外通過比較NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關序列，作者確定了羊亞科（Caprinae）和牛科（Bovidae）物種中SatI、SatII和SatIII的序列相似性和保守性。在綿羊和山羊這兩種物種中都發(fā)現(xiàn)了兩種SatIII變異體，F(xiàn)ISH探針的結合結果顯示，兩種主要的SatIII變異體（SatIII-20GG和SatIII-20CC）在染色體末端表現(xiàn)出增強的信號。

01 基于三代長讀長測序的結構變異解析

為了研究T2T-sheep1.0作為結構變異（SVs）參考基因組的表現(xiàn)，作者對兩只坦羊和歐洲野羊個體進行了PacBio測序，并將它們的PacBio長讀長測序數(shù)據(jù)與T2T-sheep1.0以及下載的其他16只羊樣本的數(shù)據(jù)集進行了比對。觀察到T2T-sheep1.0的比對不匹配率顯著降低。合并和過濾后，共鑒定出192,265個與11,987個基因（占總基因的55.93%）重疊的SVs，包括75,962個缺失和113,541個插入。而Ramb_v3.0作為參考基因組比對，所有18個樣本中產(chǎn)生的SVs均顯著減少。T2T-sheep1.0在PURs內(nèi)發(fā)現(xiàn)了額外的16,885個SVs，跨越24.20 Mb，其中大多數(shù)是缺失（n=10,979）和插入（n=5473）。另外發(fā)現(xiàn)了16個與外顯子相關的SVs，這些SVs存在所有18個個體中，這些SVs重疊的基因與生育力、羊毛和發(fā)育功能有關。在T2T-sheep1.0和Ramb_v3.0之間的共線性區(qū)域內(nèi)，也觀察到T2T-sheep1.0能顯著改善SV的檢測。例如，當使用T2T-sheep1.0作為參考時，在所有18個個體中都檢測到了Chr08上TUBE1基因外顯子中的一個缺失，并且該基因的組裝和注釋都得到了Iso-seq數(shù)據(jù)中完整轉(zhuǎn)錄本的支持。

圖4：T2T基因組提升長讀長數(shù)據(jù)SV檢測

02 基于短讀長測序的變異檢測

與之前的參考基因組Ramb_v1.0相比，使用T2T-sheep1.0作為參考基因組在NGS變異檢測方面表現(xiàn)也有顯著改進。研究團隊收集了全球810個羊NGS基因組測序數(shù)據(jù)，比較了使用T2T-sheep1.0和Ramb_v1.0作為參考時檢測到的SNP。與Ramb_v1.0相比，使用T2T-sheep1.0作為參考時，94.32%的樣本（764個）可以比對上的reads數(shù)增加了10%以上，reads的錯配率也顯著降低，而野生羊的錯配率明顯高于家羊。此外，在252個樣本中，T2T-sheep1.0比對時檢測到了至少增加了3%正確比對的reads。因此，T2T-sheep1.0在比對方面的提升表明其更適合作為羊參考基因組。

針對T2T-sheep1.0獲得的133,314,255個高質(zhì)量的SNP變異，其中2,664,979個位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)（PURs），比使用Ramb_v1.0作為參考時觀察到的多了12,060,995個。在進一步過濾掉等位基因頻率（MAFs）<0.05的SNP后，使用27,493,776個SNP進行后續(xù)分析，其中336,166個SNP位于覆蓋1635個基因的PURs內(nèi)。而使用Ramb_v1.0作為參考時，過濾掉的低質(zhì)量SNP更多，這可能是因為其相對較低的堿基質(zhì)量值（QV）。以T2T-sheep1.0為參考，鑒定到了1,265,266個結構變異（SVs），其中包括196,471個位于PURs中的SVs，主要以DELs為主，比之前使用Ram_v1.0作為參考的研究中鑒定到的SVs豐富得多。

T2T-sheep1.0為QTL映射分析提供了新的變異。根據(jù)Animal QTLdb中248項先前的研究，共鑒定了4729個與形態(tài)和農(nóng)藝性狀相關的羊QTLs。將它們的基因組坐標轉(zhuǎn)換為相對于T2T-sheep1.0的坐標，發(fā)現(xiàn)758個位于PURs中的SNP位于距離QTLs最近區(qū)域2Mb的范圍內(nèi)。

03 核苷酸多樣性和遺傳結構

研究人員使用T2T-sheep1.0所識別的SNP對野生羊和家養(yǎng)羊進行了種群分析。發(fā)現(xiàn)與所有野生種群相比，家養(yǎng)種群的平均核苷酸多樣性（π）值最高，而兩種野生羊——盤羊和亞洲野羊的π值則高于先前報道的家養(yǎng)羊。羊種群的系譜位置對參考序列敏感，使用T2T-sheep1.0作為參考的分析解決了一些在NJ樹和PCA中具有混淆系譜位置的樣本。在以Ramb_v1.0為參考的NJ樹中，來自中國西南部和哈薩克斯坦的五個種群并未被置于中亞和東亞的分支中，而在以T2T-sheep1.0為參考的NJ樹中，這五個種群被更新到了中亞和東亞的分支中。因此，之前他們可能被錯誤分類（PMSs），并且基于FST的Neighbor-Net網(wǎng)絡進一步證實了PMSs與中亞和東亞羊之間的緊密系譜關系。

基于SNP的ADMIXTURE（k=10）和基于FST的Neighbor-Net網(wǎng)絡顯示的遺傳結構模式表明，家養(yǎng)羊（六個種群）和野生羊（四個種群）根據(jù)其地理起源存在一致的遺傳分化模式。此外，歐亞大陸上的家養(yǎng)羊種群內(nèi)部也觀察到了譜系的遺傳分化。例如，中國美利奴羊以及中亞和西藏的六個品種在中亞和東亞地區(qū)受到了歐洲羊的遺傳滲入，與歐洲分支的關系更密切。非洲羊由兩個群體組成，并包含一個具有歐洲血統(tǒng)的杜泊羊品種。歐洲羊在12個南歐品種中受到了非洲羊的遺傳滲入，而北歐羊（OUE和SOL）也顯示出不同的譜系起源。

圖5：T2T基因組提升基于NGS數(shù)據(jù)的綿羊群體分析